《路易吉洋楼 3》是一款动作冒险游戏。在游戏中，玩家仍与往常一样控制角色在洋楼中探险并使用鬼怪吸尘器捕捉鬼魂。但与之不同在于新增了多项角色能力和“傀易吉”模式。同时，也对多人模式进行调整，支持 8 名玩家共同游玩“恐怖高塔”模式。
某天，路易吉、玛利欧、碧姬公主等人收到了一份度假酒店邀请信，并邀请他们前往豪华酒店度假。但在他们进入酒店一段时间后，路易吉发现玛利欧等人均被困在画中无法动弹⋯在得知事情原委后，路易吉再次哎唷·喂博士一同合作，拯救受困于画中的同伴们。
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